Наставление по применению набора антигена___

| Сделать стартовой | Добавить в избранное |

Наставление по применению набора антигена____ (алеутская болезнь норок).

Лекция Практическое занятие Инструкция Наставление

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОПРОМЫШЛЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
Главное управление ветеринарии
(госагропром СССР)

Утверждаю
Начальник Главного управления
ветеринарии Госагропрома СССР
А.Д. Третьяков

НАСТАВЛЕНИЕ
от 28.07.87 № 433-5
по применению набора антигена и контрольных сывороток
в реакции иммуноэлектроосмофореза для серологической
диагностики алеутской болезни норок (Взамен наставления
по применению набора антигена и контрольных сывороток
в реакции иммуноэлектроосмофореза для серологической
диагностики алеутской болезни норок, утвержденного
Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 4 июня 1980г).

            1. Набор для серологической диагностики алеутской болезни норок (диагностикум) выпускает биопромышленность, он содержит пять флаконов антигена и один флакон положительной сыворотки.
            1.1. Антиген представляет собой розоватую прозрачную жидкость, свободную от взвешенных частиц. Готовится из тканей норок, зараженных штаммом “П-1” вируса алеутской болезни, является стерильным и не обладает инфекционностью, серологически активен в реакции иммуноэлектроосмофореза (РИЭОФ).
            Антиген выпускают в герметически закрытых пенициллиновых флаконах по 5 мл, содержащих в 1 мл 500 доз (тест-доз) для РИЭОФ. На флаконах с антигеном должна быть этикетка или надпись несмываемой краской с указанием наименования биопрепарата, количества его в дозах, номера серии, даты изготовления.
            1.2. Контрольную позитивную сыворотку получают от экспериментально зараженных норок. Ее выпускают во флаконах по 1 мл (100 доз). На каждые 2500 доз антигена прилагается 100 доз позитивной сыворотки. На флаконах с сывороткой указывают наименование биопрепарата, его количество в дозах, номер серии.
            1.3. На каждой коробке с диагностикумом должна быть этикетка с указанием предприятия-изготовителя или его товарного знака, полного наименования диагностикума, количества вложенных в коробку диагностических препаратов в дозах, номера серии, номера госконтроля, даты изготовления, срока годности, условий хранения и обозначения технических условий. В каждую коробку должно быть вложено наставление по применению набора антигена и контрольных сывороток для серологической диагностики алеутской болезни норок.
            1.4. Антиген и контрольная сыворотка пригодны для применения в течение 12 месяцев со дня приготовления при условии хранения в темном месте при температуре от 4 до 10С. Замораживание диагностикума не допускается. Антиген и сыворотка, утратившие прозрачность, к употреблению не пригодны.
            1.5. По истечению указанного срока хранения неизрасходованный диагностикум проверяют на местах путем определения титра антигена и позитивной сыворотки аналогично методике, изложенной в п. 6. При титре не ниже 1:4 антиген разрешается использовать в течение трех месяцев, после чего его необходимо снова проверить. При титре ниже 1:4 использование антигена не допускается.
            1.6. Положительную сыворотку по истечении срока годности проверяют на местах и при титре не менее 1:32 разрешается использовать ее для РИЭОФ в течение трех месяцев, затем ее снова проверяют. При титре менее 1:32 сыворотку бракуют. В необходимых случаях допускается получение позитивной сыворотки в хозяйствах от спонтанно больных норок, давших положительную РИЭОФ с антигеном алеутской болезни норок.
            2. Реакция иммуноэлектроосмофореза, или встречного иммуноэлектрофореза, - это разновидность реакции преципитации, характеризующаяся тем, что миграция антител и антигена в агаровом геле происходит навстречу друг другу под действием электрического поля. Электрофоретическая подвижность белков зависит от величины заряда молекулы и рН раствора. При рН=8,6-8,9 антиген вируса алеутской болезни заряжен отрицательно и движется от катода к аноду, а вода, содержащаяся в агаровом геле, - навстречу к нему, увлекая за собой белки сыворотки крови и в особенности медленно движущиеся гамма- глобулины (антитела).
            2.1. РИЭОФ может быть использована для обнаружения антител и определения титров. РИЭОФ позволяет установить серологический диагноз на алеутскую болезнь через 7-10 суток после заражения, однако иногда в силу особенностей патогенеза болезни может наблюдаться выпадение положительной реакции.
            2.2. Исследование крови норок на алеутскую болезнь посредством РИЭОФ проводят ветврачи и фельдшеры звероводческих хозяйств, ветврачи практических ветеринарных лабораторий и научно-исследовательских учреждений после специальной подготовки. Исследования проводят в порядке, предусмотренном действующей инструкцией по борьбе с алеутской болезнью норок.
            3. Для постановки РИЭОФ используют прибор для электрофореза “ПЭФ-3”, “ЭФ-2” или аналогичных марок, вакуумный насос с электродвигателем, осветитель “ОИ-19” или настольную лампу с металлическим или пластмассовым абажуром, прибор для определения рН растворов (универсальный ионометр “ЭВ-74” или аналогичный), пробойник для изготовления лунок в агаровом геле, резиновую трубку, стеклянные пластинки 8х15 см, направляющую пипетку из оргстекла для пробойника, пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл, капилляры стеклянные для взятия крови у норок, кюветы эмалированные, агар для иммуноэлектрофореза, бумагу фильтровальную, мединал, веронал, двузамещенный фосфорнокислый калий , двузамещенный фосфорнокислый натрий, хлористый натрий химически чистый и дистиллированную воду.
            4. Техника постановки РИЭОФ
            4.1. На чистую обезжиренную стеклянную пластинку размером 8х15 см наливают 30 мл 1%-ного горячего раствора агара, приготовленного на буферном растворе, разведенном пополам дистиллированной водой. После застывания в агаровом геле делают лунки при помощи пробойника, соединенного трубкой с вакуумным насосом. Всего на агаровой пластинке делают 206 лунок с таким расчетом, чтобы получилось десять полных горизонтальных рядов по 20 лунок в каждом и одиннадцатый нижней неполный (для контроля) с шестью лунками, размещенными парами слева, справа и в середине ряда. Диаметр лунок должен быть 2,8 мм, глубина 1,5 мм, фактический объем около 0,01 мл, расстояние между центрами соседних лунок каждого горизонтального ряда - 6 мм. Края агаровой пластинки на расстоянии не менее 1 см не должны иметь лунок.
            Для более точного расположения лунок используют заранее размеченную миллиметровую бумагу, которую кладут под стеклянную пластинку, или накладывают направляющую пластинку из оргстекла с просверленными для пробойника отверстиями.
            При единичных исследованиях можно использовать предметные стекла или стеклянные пластинки меньшего размера.
            После разлива агара пластинки должны быть использованы не позднее двух часов при хранении во влажной камере (камера для электрофореза, эксикатор и т.д.).
            4.2. Для РИЭОФ применяют мединал-вероналовый или другие буферные растворы с рН=8Ю6-8,9, пригодные для электрофореза белков. Мединал-вероналовый буфер готовят путем растворения 10,32 г мединала в 300 мл дистиллированной воды и последующего добавления 1,84 г веронала. Раствор помешивают и держат в водяной бане при 40С до полного растворения веронала. Затем объем раствора доводят дистиллированной водой до 1 литра и измеряют рН. В том случае, если реакция приготовленного мединал-вероналового раствора получилась ниже 8,6 - следует добавить мединал, а если выше - веронал. После добавления мединала или веронала каждый раз определяют рН раствора, доводя его до нужной концентрации.
            Ежедневно после окончания работы буферный раствор сливают в одну емкость и хранят при комнатной температуре. Буферный раствор при массовых исследованиях используют в течение 3-4 дней. При ухудшении четкости линий преципитации в контроле следует заменить раствор и проверить активность диагностикума в соответствии с п. 1.5.
            4.3. Кровь для исследования у норок берут в стеклянные капилляры, которые с одного конца закрывают пластилином и центрифугируют при 1500-3000 вращений в минуту в течение 5 минут. Затем отламывают часть капилляра с сывороткой и, не допуская ее разбрызгивания, осторожно выдувают при помощи специальной груши или резиновой трубки в очередную лунку четного вертикального ряда. При необходимости можно использовать цельную кровь, осадок эритроцитов, гемолизированную или хилезную сыворотку. Для контроля реакции в четные лунки 11 горизонтального неполного ряда вносят положительную сыворотку. Антиген закапывают пастеровской пипеткой во все лунки нечетных вертикальных рядов (включая и контрольные) и помещают пластинку в камеру электрофореза с тем расчетом, чтобы ток проходил параллельно горизонтальным рядам. К краям пластинки прикрепляют по 4-5 полосок фильтровальной бумаги и опускают их свободные концы в ванны с буферным раствором, наполненные примерно на 1/3 объема. Камеру закрывают крышкой и подключают к выпрямителю тока, чтобы положительный полюс был справа (со стороны крайнего вертикального ряда с сыворотками). Сила тока должна составлять 10-15 миллиампер на каждую стеклянную пластинку (0,080-0,12ма/см²), напряжение на выходе - 120-220 в. Требуемые параметры тока достигаются путем изменения количества полосок фильтровальной бумаги, если регулировка тумблером не приводит к желаемому результату.
            4.4. Предварительный учет реакции проводят через 45 минут после размещения пластинки в силовом поле. Для этого отключают от сети выпрямитель, открывают крышку камеры, вынимают пластинку и просматривают ее в косопроходящем свете (осветитель ОИ-19 или другие источники света) на темном фоне в затемненном помещении. Положительная РИЭОФ характеризуется наличием тонкой четкой прямой линии преципитации в горизонтальных рядах геля примерно на середине расстояния между лунками с сывороткой и антигеном. Расплывчатые полосы в геле, диффузные или ограниченные изменения его прозрачности, а также отсутствие изменений расцениваются как отрицательный результат. Окончательный учет реакции проводят после экспозиции стекла с агаровой пластинкой в гипертоническом растворе (12,5%) хлористого натрия в течение 7-10 минут и последующего отмывания в дистиллированной воде (6-18 часов) для удаления неспецифических полос сывороточного белка. При обнаружении едва различимой линии преципитации результат РИЭОФ считается сомнительным. В этом случае реакцию ставят повторно с новой пробой сыворотки. Подтвержденный сомнительный результат РИЭОФ засчитывается как положительный.
            Показания РИЭОФ признают действительными, если на данной пластинке в 11 горизонтальном ряду во всех трех контролях будет ясно выражена линия преципитации. Положительный результат РИЭОФ указывает на заражение норок алеутской болезнью и на необходимость изолированного их содержания до момента убоя.
            5. Результат исследования крови норок в хозяйствах записывают в акте с указанием даты проведения исследований, количества и процента реагирующих норок по отделениям и бригадам, наименования диагностикума, номера его серии и госконтроля, предприятия-изготовителя, срока годности, фамилии, имени и отчества ветработника, проводившего исследования. Один экземпляр акта хранится в хозяйстве, второй направляется главному ветврачу района.
            6. Для экспериментальных целей в РИЭОФ испытывают не только цельные сыворотки и антиген, но и их последовательные разведения. Для титрования антител у обследуемых норок берут кровь в пробирках в объеме не менее 1-3 мл и получают сыворотку общепринятым способом, затем готовят ее последовательные двукратные разведения в физиологическом растворе от 1:2 до 1:262144 при помощи микротитратора “Такачи” или макрометодом в пробирках. Каждое разведение испытуемой сыворотки вносят в отдельную лунку четных вертикальных рядов: в нечетные ряды закапывают не разведенный стандартный антиген и пластинку помещают в камеру для электрофореза на 45 минут. Одновременно ставят контроль положительной стандартной сыворотки, начиная с разведения 1:2 до определенного титра (1:64) со стандартным антигеном. учет реакции проводят в соответствии с п. 4.4. За титр антител в испытуемой сыворотке принимают наибольшее ее разведение, в котором произошла реакция при одновременном положительном результате с контрольной позитивной сывороткой в предельном (1:64) или половинном (1:32) титре.
            При титровании антигена готовят последовательные двукратные его разведения от 1:2 до 1:64 в фосфатно-буферном растворе с рН=7,2-7,4, приготовленном по общепринятой прописи. В лунки четных вертикальных рядов вносят не разведенную контрольную позитивную сыворотку, в нечетные ряды - антиген в последовательных разведениях. Пластинку помещают в камеру для электрофореза и через 45 минут проводят учет реакции, как указано в п. 4.4.
            7. По истечении срока годности диагностикума или при подозрении на снижение его активности проводят титрование антигена и сыворотки как указано в п. 6 с той лишь разницей, что антиген титруют до разведения 1:4 (с неразведенной сывороткой), а сыворотку в разведении до 1:32.
            8. В случае появления неспецифических реакций или слабой активности диагностикумов применение препаратов данной серии прекращают и сообщают Всесоюзному государственному научно-контрольному институту ветеринарных препаратов Госагропрома СССР (123022, г. Москва, Д-22, Звенигородское шоссе, 5) и предприятию-изготовителю набора. Одновременно в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии МСХ СССР от 8.09.82 г. № 116-6а “О порядке предъявления рекламаций на биопрепараты” в ВГНКИ ветпрепаратов доставляют нарочным 1 коробку набора диагностикумов.